蛋白质多样性是基因组的体现，磷酸化蛋白检测方法的选择对于研究生物学过程至关重要。文章首先介绍了蛋白质的装饰，包括翻译后修饰、可变剪接和磷酸化等方式。随后介绍了不同类型的蛋白质磷酸化检测方法及其优缺点，包括质谱法、抗体分析、WesternBlot技术等。最后，提出了新的磷酸化蛋白检测方法——Phos-tag，分为Phos-tagAcrylamide和Phos-tagBiotin两种。该方法具有操作简便、不同磷酸化状态可同时观察等优点，为磷酸化蛋白的研究提供了新的思路和方法。通过这些技术，研究人员可以更准确地了解蛋白质的磷酸化状态，为相关生物学研究提供更加丰富的信息和数据。
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1、蛋白质装饰
人类基因组包含23,000个基因，然而，这些基因产生了显著更大的蛋白质组。这是由于在转录后和翻译后水平的多样性。单个基因在转录后，可以通过可变剪接，偶尔通过RNA编辑，产生多个mRNA分子。许多蛋白质在翻译后，通过蛋白质修饰和/或蛋白质剪切，产生成熟的和功能型的形态。通过广泛的翻译后修饰，蛋白质的结构和功能就多样性了。
相比于基因组包含的全部基因，人类蛋白质组包含了更多的功能性多肽，部分归因于，翻译的同时和翻译后的蛋白修饰。
蛋白质装饰
A,翻译后修饰，以及可变剪接，在从单一基因生成多种功能蛋白的过程中发挥重要作用。
B,翻译后修饰，作为细胞内信号(磷酸化)，蛋白稳定性的调控(泛素)，转录调控(组蛋白乙酰化和甲基化)，细胞表面信号(糖基化)等多种多样的细胞功能中发挥重要作用。
磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，同时也是原核和真核生物中最重要的调控修饰形式。
编码蛋白激酶和磷酸酶的基因约占真核生物基因组的2％～4％(酵母基因组中约有120个激酶基因和40个磷酸酶基因，人类基因组中约有500个激酶基因和100个磷酸酶基因)。人类蛋白质组中含有10万多个潜在的磷酸化位点，大多数磷酸化蛋白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，在胞内活性调控中发挥着重要的作用。
蛋白磷酸化是多种信号传导途径中的重要环节，细胞内大部分重要的生命过程都涉及蛋白磷酸化。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
根据磷酸氨基酸残基的不同，磷酸化蛋白大致可分为四类：
蛋白质碳酸化具有以下功能：
(1)磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐),如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统(PTR)的组氨酸蛋白激酶(HPr);
(2)磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基)或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基);
(3)天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。
2、碳酸化检验方法比较
蛋白质修饰的四种常见类型及其常用研究方法：
检测蛋白碳酸化的方法及其优缺点
质谱作为一般的蛋白质修饰分析的工具
A,质谱(MS)分析是利用肽电离分析蛋白质碎片的质量电荷比(m/z)。进一步(MS/MS分析)，肽段进一步碎片化以获得更多的数据。
B,LC-MS/MS,蛋白质的复杂混合物，通过液相色谱进行分离(左图)，然后MS/MS(右图)确定每个多肽片段[19492072]。
碳酸化特异兴抗体有两种类别
第一类是通用的磷酸化酪氨酸，磷酸化丝氨酸，磷酸化苏氨酸抗体，将结合于任何磷酸化酪氨酸，磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸分子，与邻近的氨基酸残基无关。
第二类包括的抗体是磷酸化特定氨基酸表位抗体。
用计算机方法或用质谱法识别了(假定)的磷酸化位点之后，可以从公司购买针对磷酸化位点的通用抗体，通过免疫沉淀的步骤，以确定目标蛋白质是否在特定类型的位点被磷酸化(例如一个典型的cyclin/cdk位点)。也可以使用针对一个特定的磷酸化氨基酸，如磷酸化酪氨酸，制备的抗体。接下来，针对特定表位制备磷酸化抗体，通过简单的免疫印迹检测磷酸化。为了分析大量的样品，可以用酶联免疫吸附试验，目标蛋白结合到膜上，然后用磷酸化特异抗体检测。
通过抗体分析的蛋白磷酸化检测
A.磷酸化过程中，一个磷酸基团被结合到丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基。这个磷酸基团可以被用作标记，无论是使用放射性磷酸盐进行放射性测量，或是使用针对磷酸化氨基酸的抗体。
B.体内磷酸化检测确定c-Src对TH1的磷酸化。异位表达这两个蛋白，对Myc标签TH1进行免疫沉淀，使用通用的酪氨酸磷酸化抗体检测在c-Src表达有或无的情况下TH1的磷酸化[22238675]。
3、WesternBlot免疫印迹
蛋白免疫印迹(WesternBlot)
原理：蛋白质印迹法是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。
特点：先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。
WesternBlot流程图
磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项
(1)由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个免疫检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，我们在样品制备时，需要在细胞裂解液中加入足量的并且是新鲜的磷酸酶抑制剂，如PhosphoSafe 系列。外源性的磷酸酶主要是由实验过程中的其它试剂带入的，比如我们要确保封闭剂中不含磷酸酶等；
(2)同时，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以做磷酸化Western Blot的另一个关键是要尽量使用清洁的新鲜的溶液和新做的SDS聚丙烯酰胺凝胶，并且最好在样品制备完就立刻上样，当天完成SDS-PAGE和Western Blot 检测。如果要使用同一块Blot进行全蛋白的免疫检测，就需要先做磷酸化的检测再做全蛋白的检测，以尽量避免磷酸化信号的丢失，这点非常重要。
一、一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。
细胞磷酸化蛋白提取：
1. 提取液制备：每500ul冷的蛋白提取液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个细胞，在4℃，1000rpm条件下离心5-10分钟，小心吸取培养
基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每5×106个细胞中加入500ul冷的蛋白提取液，混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟。5. 在4℃，14000rpm条件下离心15分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到磷酸化蛋白。
7. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。组织磷酸化蛋白提取：
1. 提取液制备：每500ul冷的蛋白提取液中加入2ul蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取100mg组织样本剪碎，加入总蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃，10000rpm条件下离心5分钟。
4. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到磷酸化蛋白。
5. 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
(特别注意，要让组织保持低温，以保证蛋白不会脱磷酸化。若组织在液氮中研磨，研钵也要先在低温下保存，而且要保证研钵周围不挂水珠，这才能真正保证低温。)
二、加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。
三、磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。
四、最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。
五、抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。
六、检测磷酸化蛋白的抗体是针对该蛋白的特异性磷酸化位点的，而检测总蛋白的抗体一般针对的是该蛋白别的位点，故而磷酸化抗体检测不到总蛋白，而总蛋白抗体能检测包括磷酸化和未磷酸化蛋白在内的目的蛋白。如果使用同一块Blot进行全蛋白的免疫检测，就需要先做磷酸化的检测再做全蛋白的检测，以尽量避免磷酸化信号的丢失。
注：将膜与strip buffer(膜再生液)封入塑料薄膜中，完全浸入水浴锅中，使四周都能接触恒温水，50度水浴30min，用TBST洗5分钟，3次即可去除已孵育结合的抗体。
七、做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的band以外，往往会出现非特异性的band。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的band，而没有你想要的band，所以压片以后，你一定要根据markers比对一下，你压出的band分子量是否正确。
八、磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则backgroud太深，盖住想要的那条band，时间过短则可能没有band或者band太浅。
九、磷酸化蛋白WB时，用TBST洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗5min 3次即可，宁愿background深一些，总比做不出来强得多。另外，洗的时候，最好不要把几张membrane叠在一起洗。
磷酸化蛋白Western blot高背景的可能原因
(1) 磷酸化蛋白抗体本身特性造成的，这一点除了换抗体，否则无法改善。
(2) Nitrocellulose/PVDF膜质量不高。
(3) ECL荧光发光剂质量不高。
(4) 封闭时要用含5%non-fat milk的TBST，室温1小时，时间不宜过长。
(5) 加入一抗后要4℃过夜。而且一抗要用合适的buffer稀释，一定要根据抗体公司的protocol建议之buffer稀释。就Cell signaling公司的抗体而言，大部分抗体要用含5%BSA的TBST稀释，如改用5%non-fat milk的TBST稀释，除了造成高背景以外，还很容易使抗体不稳定，重复利用的次数会明显下降。当然，Cellsignaling公司也有用5%non-fat milk的TBST稀释的抗体，如PARP antibody (#9542)。
(6) 另外，还要确定二抗是否合适。比如，用相同的二抗压其它抗体时，是否也有相同的高背景。
4、新方法介绍
全新方法：用于磷酸化蛋白的分离和检测
无特异性磷酸化抗体，可用Phos-tag来分离和检测磷酸化蛋白。
Phos-tag是一种能与磷酸离子特异性结合的功能性分子。
分为两类：Phos-tagAcrylamide和Phos-tagBiotin。
Phos-tagAcrylamide
分离：SDS-PAGE分离不同磷酸化水平的蛋白。
该方法可以在同一个电泳条带里面同时观察靶蛋白的不同磷酸化状态，以及外因引起的磷酸化状态的改变。
只要在配置SDS-PAGE胶的时候，将phos-tag配成的溶液加入分离胶里面，就配置成Phos-tag聚丙烯酰胺凝胶了，后续用跟常规SDS-PAGE一样的步骤进行操作就可以，用起来简单。
如果想进一步确认一下分开的这些条带是不是你要的蛋白，可以用常规的抗体来确认(常规抗体就可以代替多个磷酸化抗体哦，省时省钱又省力)。
特点
•非放射性元素，非荧光物质
•磷酸化蛋白亚型可以在同一电泳道分离出多条带
•操作简便，与常规SDS-PAGE蛋白电泳相似
•Phos-tag的结合特异性与氨基酸种类、序列无关
•Phos-tagSDS-PAGE实验后，可进行常规的免疫组化、质谱等
•性质稳定，溶于蒸馏水后可以稳定保存至少3个月
•磷酸化和非磷酸化蛋白可以同时被分离检测
•不同位点磷酸化修饰以及磷酸化程度不同的蛋白在同一泳道中因迁移率不同而被分离开来
Phos-tagBiotin
检测：代替westernblot检测中的磷酸化抗体
原理如图所示
先使用常规的方法，将SDS-PAGE胶上的蛋白转移到PVDF膜上，然后Phos-tagBiotin就可以跟膜上磷酸化蛋白的磷酸根结合，接着加入HRP耦联的链霉素，再加入底物进行显色，就可以检测磷酸化蛋白了。
(如果研究的蛋白没有相应的磷酸化抗体就可以尝试用这个方法。)
应用举例
如图所示：图A：加入磷酸酶，磷酸化蛋白水平下降，而没有加磷酸酶的磷酸化蛋白水平较高。
图B：加入PKA，磷酸化蛋白水平增加，而没有加PKA的
磷酸化蛋白水平较低。而检测这种磷酸化状态的改变用的就是Phos-tagBiotin。
特点：
•无辐射;
•无需PVDF膜的封闭处理;
•Phos-tag的特异性结合与氨基酸种类、序列无关;
•可适用于免疫印迹和质谱分析等后续工作;
•Phos-tag-BTL母液可稳定保存至少6个月;
•实验流程与使用HRP标记抗体相类似。
文献：
[1]KouMotani,HidetakaKosako.Phosphoproteomicidentificationandfunctionalcharacterizationofproteinkinasesubstratesby2D-DIGEandPhos-tagPAGE[J].BBA-ProteinsandProteomics,2018.
[2]刘佳,周光前,尹献辉,李雪芹,王优雅,胡静仪,王子梅.磷酸化标签方法检测异染色质蛋白1αDNA损伤后蛋白磷酸化状态[J].华西医学,2012,27(06):828-831.
[3]李阳,李玉红.Phos-tag技术在磷酸化蛋白质组学中的应用[J].生命的化学,2010,30(01):145-148.
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